Вивчення та оцінка канцерогенезу

Канцерогенез вивчається за допомогою різних стандартизованих токсикологічних тестів. Перша частина цих тестів проводиться in vitro, і - якщо вони позитивні - ми приступаємо до експерименту in vivo. Цей експериментальний поетапний підхід називається ПІДХОДОМ ТОЧКИ РІШЕННЯ-послідовність випробувань, які припиняються в кінці кожного випробування, щоб вирішити, як продовжити випробування. Існує п'ять етапів:

ФАЗА А: будова та характеристики канцерогенної сполуки;

ФАЗА: на цій фазі короткочасного тестування in vitro використовуються клітини ссавців. Найбільш часто використовувані клітини - це гепатоцити, оскільки вивчається ступінь відновлення пошкодження, яке гепатоцит розвиває відповідно до тяжкості пошкодження, спричиненого речовиною. Коротко кажучи, ми визначаємо не пошкодження як таке, а те, скільки системи відновлення було активовано клітинами печінки.

Реалізована процедура полягає у формуванні 3 культур гепатоцитів. У першій культурі гепатоцити здорові, у другій обробляють досліджуваною речовиною і, нарешті, у третій обробляють контрольною речовиною, яка, безумовно, є канцерогенною.Ці три культури містять радіоактивну піримідинову основу - тритієвий тимідин, який діє як маркер.

Якщо сполука, що досліджується, викликає мутацію в ДНК, клітина реагує на цю проблему, активуючи системи відновлення. Шматок ДНК, який зазнав мутації, розрізається, і завдяки дії ДНК -полімерази відсутній фрагмент замінюється новим. Для корекції ДНК -полімераза використовує нові основи, включаючи тритієвий тимідин. Аналіз радіоактивності визначає рівень мутації в оброблених клітинах: чим вище радіоактивність, тим більша мутація ДНК.

Також у фазі В також проводяться тести на бактерії, щоб мати можливість вивчити, чи є якісь зворотні мутації. Використовувані бактерії є сальмонелами, які вже є носіями мутацій. Мутація стосується синтезу гістидину, тому сальмонели не можуть рости без гістидину. Ці колонії бактерій частково приймають для обробки досліджуваною речовиною, частково для негативного контролю, а частково для позитивного контролю, потім перевіряють відомим канцерогеном. Якщо ця досліджувана речовина є непрямою генотоксичною речовиною, фермент, що метаболізується, повинен бути введений у поживне середовище. На даний момент є 3 культури, які будуть висіватися і вирощуватися в чашках Петрі (у поживному середовищі немає гістидину). Якщо не було жодних мутацій канцерогену для тестування, теоретично їх не повинно бути на пластинах .Якщо канцероген мав мутагенну дію, він міг змінити першу мутацію та створити другу мутацію, здатну вирощувати бактерії на культуральному середовищі, що не містить гістидину. У цьому випадку друга мутація змінює першу мутацію та Нарешті, якщо в piasta petri відбувається значне зростання, канцероген є прямим.
Завжди за допомогою тесту in vitro можна визначити хромосомну цілісність. Цей тест завжди проводиться на клітинах ссавців і використовується для тестування токсичних речовин, здатних викликати мутації деяких ферментів, що відповідають за біосинтез ДНК. піддається аналізу in vitro Для визначення того, чи впливає досліджувана речовина на цілісність та кількість присутніх хромосом, використовується мікроядерний тест. Мікроядра - це везикули, які утворені з частиною хроматину всередині. Хроматин, включений у ці мікроядра, може бути як цілими хромосомами, так і фрагментами хромосом. Результатом цього випробування буде визначення речовин, які є певними кластогенними отрутами та веретеноподібними отрутами. Кластогенна речовина виробляє мікроядра з осередковими фрагментами хромосом, тому речовина викликає розрив хромосом, а не отруйна речовина веретена мікроядра, що всередині нього присутні цілі хромосоми.
Якщо досліджувана речовина викликає генотоксичність в одному або кількох випробуваннях, це визначається як дуже підозріле, тому воно переходить безпосередньо до фази D. Якщо, з іншого боку, досліджувана речовина не викликає генотоксичної дії, вона переходить до фази дослідження C, оскільки він може бути промотором.

FASEC: на цій фазі можна проводити тести in vitro та in vivo.

Для тестів in vitro можна було продемонструвати можливість промоторної речовини розірвати проміжки між нормальними клітинами та пухлинними клітинами з подальшим проходженням речовин між двома клітинами.

Тест in vivo - це індукція пухлин шкіри у мишей. Речовина, що перевіряється, наноситься два -три рази на тиждень на шкіру миші. Протягом 2/3 місяців, якщо ця речовина є промотором, можуть утворитися папілома. У мишей враховуються два основні дані: кількість мишей, уражених папіломами, і кількість папілом, присутніх на кожній тварині. Якщо речовина діє як промотор і розвиває пухлину у обробленої миші, це означає, що це дійсно речовина з промоторним ефектом.

Після завершення цих випробувань ми переходимо до довгострокових тестів in vivo.

ФАДИРОВАНО: на цій фазі випробовуються всі сполуки, які виявляються мутагенними, і всі сполуки, які не є мутагенними. Тести, які можна проводити, різні, деякі з них - це тести, проведені на печінці, на легенях і, нарешті, на грудях.

Тест на печінку демонструє утворення не новоутвореної пухлини, а неопластичного вогнища, отже, того, що готується стати пухлиною. Клітини цього вогнища вже є атиповими клітинами, тому вони зазнали мутації і готуються стати неопластичними клітинами. Через певний час, завдяки розтину, визначається утворення передпухлинних вогнищ шляхом обчислення кількості та обсягу цих передпухлинних утворень.

Тест на легені дозволяє визначити аденому, яка є "аномалією клітин легеневої тканини. Також у цьому випадку легеневу тканину щура досліджують через досить тривалий час (місяці) (ці аденоми легко ідентифікувати, оскільки є білуватими вузликами на легеневому епітелії).
Тест на молочні залози дозволяє визначити пухлини в залозистій тканині. Завжди оцінюється кількість утворених аденом та кількість тварин, що мають аденоми.

Якщо є позитивні результати цих випробувань, досліджувана речовина є справді канцерогеном. На цьому етапі ми переходимо до проведення дорогих тестів з дуже довгим часом виконання.

ФАЗА: на цій фазі різну кількість тварин, від 20 до 50, піддають довгостроковим випробуванням, які є дуже дорогими і займають багато часу, щоб отримати певні результати; ми говоримо приблизно про 1/8 життя тварини.Можливо, що в процесі цих випробувань деякі тварини гинуть, але їх завжди досліджують за допомогою розтину та гістологічного дослідження. Вибраними тваринами завжди є щури та миші, і лише 70-80% виживають до кінця довгострокових випробувань. Тварин, які використовуються, просто відлучають, оскільки вони молодші, тим чутливіші до лікування. Протягом тривалого періоду випробування дослідника завжди підтримує математик-статистик, здатний врахувати всю зібрану інформацію та відтворити різні дані.

Дози, випробувані на тваринах, починаються з максимальної допустимої дози та всіх її множин, і оцінюється реакція доза-відповідь у тварини.
Введення повинно завжди наближатися до шляху, через який чоловік може контактувати з досліджуваною речовиною, отже, через рот, через шкіру або дихальні шляхи, тоді як якщо перевіряється канцерогенність препарату, також корисно проводити внутрішньовенне введення.
Випробуваних груп тварин 4 (по 50 тварин для кожної групи):

Група НАІФ, яка не має лікування;
Група, оброблена транспортним засобом;
Група, оброблена досліджуваною речовиною;
Група, оброблена відомим канцерогеном.

Дуже важливо, щоб кількість тварин у кожній групі була максимально рівною. Насправді, якщо різниця у кількості тварин занадто велика, статистичний тест може виявитися фальшивим.
Проводяться такі оцінки:

Загальна частота пухлин;
Частота деяких пухлин;
Частота тварин з більш ніж одним типом пухлини;
Кількість видів раку тварин.

Наприкінці всіх цих етапів дослідження речовина класифікується у рейтингу, встановленому IARC (Міжнародним агентством досліджень та розробок щодо раку) та Агентством з охорони навколишнього середовища (EPA).